反芻動物糞中阿克醇濃度測定方法

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1、ICS?65.020.30 B40 ????? DB15 內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn) DB 15/ T—XXXX ????? 規(guī)模化羊場絨山羊舍飼管理技術(shù)規(guī)程 反芻動物糞中阿克醇濃度測定方法 Test method of for archaeol in ruminant 點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識 ????? XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實(shí)施 內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局???發(fā)布 DB15/ T—XXXX 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫（GB/T 1.1-2009）起草

2、。 本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孫海洲、張春華、李勝利、桑丹、張崇志、金鹿、珊丹、凌樹禮、任曉萍、伶俐。 5 反芻動物糞中阿克醇濃度測定方法 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了反芻動物糞中阿克醇濃度的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于奶牛、綿羊、山羊等反芻動物糞中阿克醇濃度的測定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改

3、單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 GB/T 3358.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)詞匯及符號 第1部分：一般統(tǒng)計(jì)術(shù)語與用于概率的術(shù)語 3　 術(shù)語及定義 下列術(shù)語和定義適用于本文件。 3.1　 阿克醇archaeol 阿克醇（2,3-diphytanyl-O-sn-glycerol，1,2-雙植烷酸甘油）為反出動物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌膜脂的基本結(jié)構(gòu)，通過測定糞中阿克醇含量即可測算甲烷產(chǎn)量。 3.2　 古細(xì)菌archaea 常生活于熱泉水、缺氧湖底、鹽水湖等極端環(huán)境中的細(xì)菌。具有一些獨(dú)特的生化性質(zhì)，如膜脂由醚鍵而不是酯鍵連接，其營養(yǎng)方式亦不同于常規(guī)生物，如硫氧化等。

4、包括3類不同的細(xì)菌：產(chǎn)甲烷細(xì)菌、極端嗜鹽細(xì)菌和嗜酸嗜熱細(xì)菌，已知的瘤胃古細(xì)菌絕大部分為產(chǎn)甲烷古菌。 3.3　 相對相差 relative difference 重復(fù)性條件下獲得兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值與算術(shù)平均值的比值。 4　 試劑和材料 4.1　 如無特別說明，所用試劑均為色譜純試劑，水（應(yīng)符合GB/T 6682）規(guī)定的一級水。 4.2　 二氯甲烷。 4.3　 甲醇。 4.4　 氯仿。 4.5　 磷酸二氫鉀。 4.6　 氫氧化鉀。 4.7　 鹽酸。 4.8　 三甲基氯硅烷。 4.9　 N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。 4.10　 乙酸乙酯。 4.11　

5、1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerol（1,2-雙二十六烷基甘油）。 4.12　 1,2-di-O-phytanyl-sn-glycerol（1,2-雙植烷酸甘油）。 4.13　 水溶液：所用的水用二氯甲烷（DCM）提取三次后使用。 4.14　 活化硅膠柱。 5　 儀器和設(shè)備 5.1　 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊源（EI源）。 5.2　 分析天平（分度值0.0001 g）。 5.3　 超聲儀。 5.4　 常規(guī)離心機(jī)。 5.5　 旋渦混勻器。 5.6　 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 5.7　 水浴鍋。 6 樣品處理 6.1 樣品采集和處理 采集試驗(yàn)基地牛

6、/羊新鮮糞便，于85 ℃烘干72 h，研磨后以備分析。 7 測定步驟 7.1 總脂的提取 7.1.1 全脂提取 將內(nèi)標(biāo)1,2-雙二十六烷基甘油（43.4 μg；Santa Cruz Biotechnology Inc., CA)，加入到約300 mg干燥研磨后的糞樣中（三份平行樣），采用單相提取方法(Bligh and Dyer，1959)提取全脂，并用50 mL二氯甲烷提取3次。 7.1.2 總脂提取 加入單相溶劑（2 mL）至糞樣中，超聲處理15分鐘，990g離心5分鐘，收集含有脂質(zhì)的上清液。沉淀部分重復(fù)上述操作，共提取三次。合并上清液，加入2mL緩沖液與2 mL氯仿，

7、旋渦混勻，990 g離心5分鐘。收集有機(jī)相（底層），上層為水相，用2 mL氯仿沖洗水相2次，合并萃取物，轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，用氮?dú)庑D(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，獲得總脂。 7.2 去除極性頭基團(tuán) 獲得的總脂中加入5mL的5%鹽酸甲醇到總脂中，于密封管中100 ℃加熱3 h。冷卻后，加入2 mL雙蒸水和2 mL氯仿，產(chǎn)生有機(jī)相和水溶相。收集有機(jī)層（底層），水溶相用氯仿沖洗兩次。合并萃取物，用氮?dú)庹舭l(fā)干燥。 7.3 分餾脂質(zhì) 使用一個活化硅膠柱（0.5 g硅膠，60*10-10 m粒度，125 ℃活化，冷卻至室溫，立即轉(zhuǎn)移到玻璃柱中）進(jìn)行分離。玻璃柱預(yù)先用二氯甲烷處理（2倍柱容），總脂混合物加入柱內(nèi)時也使

8、用同一溶劑。非極性部分用二氯甲烷（3倍柱容）洗脫，接著醇部分用二氯甲烷:甲醇(1:1體積比，3倍柱容）洗脫。溶劑用N2氣流蒸發(fā)干燥。 7.4 GC-MS分析 醇部分加入50 μL含1 % 三甲基氯硅烷的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA+1%TCMS）中進(jìn)行衍生化，70 ℃加熱1 h。接著BSTFA在N2氣流中蒸發(fā)干燥。樣品溶解于乙酸乙酯中，進(jìn)行GC-MS分析。 7.5 阿克醇定量分析 7.5.1 色譜條件 a）色譜柱：非極性固定相硅膠色譜柱（ZB-1，60 m0.32 mm0.1μm；Phenomenex Ltd., Macclesfield,UK）。 b）色

9、譜柱溫度程序：柱起始溫度70 ℃，以20 ℃/min升溫至130 ℃，然后以2 ℃/min 升溫至300 ℃。 c）載氣：高純氮?dú)狻? d）進(jìn)樣口溫度：300℃。 e）進(jìn)樣量：1 μL。 f）進(jìn)樣方式：手動進(jìn)樣。 g）地址轟擊源 ：70 ev。 h）離子源溫度：250 ℃。 i）GC-MS接口溫度：250℃。 j）選擇離子監(jiān)測：特征離子為m/z 130，278，284，426。 7.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 通過加入100 ng/μL的內(nèi)標(biāo)(1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycerol; Mstd)，與古細(xì)菌膜脂標(biāo)準(zhǔn)品(1,2-di-O-phytanyl-s

10、n-glycerol; Mx)5,25, 50, 150及250 ng/μL，利用GC-MS制作校準(zhǔn)曲線。測定內(nèi)標(biāo)和膜脂標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Astd和Ax。標(biāo)樣質(zhì)量（ng）的比值Mx/Mstd，與峰面積的比值A(chǔ)x/Astd有一定的關(guān)系，具體的曲線回歸方程式如下： Ax/Astd = 1.32 Mx/Mstd -0.0708 因?yàn)榍€Ax/Astd在Y軸，運(yùn)算結(jié)果是解出X軸的Mx/Mstd： Mx/Mstd = (Ax/Astd + 0.0708)/1.32 每個樣品加了43.4 μg的內(nèi)標(biāo)，因此： Mx = (Ax/Astd + 0.0708)/1.32 43.4. 7.6 平行試驗(yàn)

11、 按以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行測定。 7.7 空白試驗(yàn) 除不稱取試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。 8 結(jié)果計(jì)算和表述 取兩次測定的算數(shù)平均值作為結(jié)果，保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。 9 重復(fù)性 每試樣稱取兩個平行樣進(jìn)行測定，取平均值為分析結(jié)果。 根據(jù)GB/T 3358.1，在重復(fù)條件下同一樣品獲得的測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。 10 回收率的測定 本方法的回收率≥72%。 附 錄 A （資料性附錄） 阿克醇測定色譜圖 圖 A.1 阿克醇測定色譜圖 注： 1．單相溶劑由緩沖液、甲醇和氯仿按4:10:5的體積比配制而成。 2．緩沖液為0.05 M磷酸二氫鉀溶液（6.8 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水溶液），用氫氧化鉀片調(diào)為pH 7.2。 _________________________________