FDA藥物相互作用研究指南

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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,FDA藥物相互作用研究指南,藥學(xué)部,盧進(jìn),2010.7.13,介紹內(nèi)容,簡(jiǎn)介,藥物相互作用研究的背景知識(shí),藥物相互作用研究的一般策略,體內(nèi)藥物相互作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),藥物代謝酶的確認(rèn),CYP酶抑制/誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià),P-gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究,簡(jiǎn)介,美國(guó)FDA,藥物

2、評(píng)價(jià)和研究中心(CDER),生物制品評(píng)價(jià)和研究中心(CBER),2006年9月,共同發(fā)布,藥物相互作用研究-實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及其在劑量調(diào)整和處方標(biāo)簽中的應(yīng)用的指南,簡(jiǎn)介,指南為新藥和新生物制品的研發(fā)者提供了：,藥物代謝,藥物轉(zhuǎn)運(yùn),體內(nèi),體外,相互作用研究規(guī)范,簡(jiǎn)介,內(nèi)容涉及藥物相互作用研究的全過(guò)程,包括：,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究人群或體外研究用細(xì)胞、微粒體,探針底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑的選擇,觀察指標(biāo)、樣本量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，等,除了代謝性藥物相互作用以外，還對(duì)P糖蛋白介導(dǎo)的藥物相互作用的研究方法給予了詳細(xì)的指導(dǎo),（與1999年版本相比的增加內(nèi)容）,1.藥物相互作用研究的背景知識(shí),包括細(xì)胞色素P450(C

3、YP)酶在內(nèi)的多個(gè)藥物代謝酶都能被聯(lián)用的藥物所抑制/誘導(dǎo),藥物濃度發(fā)生巨大改變,影響藥物安全性和有效性,同時(shí),藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,相關(guān)的藥物相互作用受到越來(lái)越多的關(guān)注,如:P-gp、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OAT），等。,表一,：人類主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和已知的底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑,2.藥物相互研究的一般策略,根據(jù)體外代謝、已知和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定體內(nèi)相互作用研究必要性。,流程圖,目前尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6酶被誘導(dǎo)的情況，而,CYP2C,CYP2B和P-gp,是可以和,CYP3A,一起被誘導(dǎo)的。,CYP3A,對(duì)所有已知的誘導(dǎo)劑,都很敏感,。,因此，考察受試藥物能否能夠誘導(dǎo),CYP1A2,CYP

4、2C8,CYP2C9,CYP2C19和CYP3A,時(shí)，只需要體外考察對(duì),CYP1A2,和,CYP3A,酶的誘導(dǎo)情況即可。,若體外實(shí)驗(yàn)顯示受試藥物對(duì)CYP3A無(wú)誘導(dǎo)作用，那么就可以免做對(duì)CYP2C和CYP2B的誘導(dǎo)研究。,3.體內(nèi)藥物相互作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究群體,底物和作用藥物的選擇,給藥途徑,給藥劑量,3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),思路：比較底物（,S,）濃度在,有和沒(méi)有,作用藥物（,I,）時(shí)的變化情況。,隨機(jī)交叉法,（先服用,S,后服用,S+I,組、先服用,S+I,組后服用,S,組）,單次序交叉法,（總是先服用,S,后服用,S+I,組、或相反）,平行設(shè)計(jì),（一組服用,S,一組服用,S+I,）,設(shè)計(jì)

5、方案時(shí)應(yīng)該注意：,(1)如果實(shí)驗(yàn)需要達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度而底物或作用藥物和(或)其代謝物的半衰期較長(zhǎng),此時(shí),不能采用額外給予一個(gè)負(fù)荷劑量的方法,加快達(dá)到穩(wěn)態(tài)。,(2)如果作用藥物是一個(gè)快速可逆的抑制劑,其服用時(shí)間應(yīng)該在測(cè)定當(dāng)天服用底物前或同時(shí)服用,這樣才能增加其敏感性。,對(duì)于基于作用機(jī)制的抑制劑(如紅霉素),在服用底物藥物,前,服用作用藥物可以,放大相互作用強(qiáng)度,。,如果作用藥物(抑制劑或誘導(dǎo)劑)的吸收受多種因素的影響(如胃pH值),則需要采取適當(dāng)?shù)姆椒?控制,吸收方面的變化。,(3)為了排除由于食物、飲料、果汁等影響代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而引起誤差,指南建議實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要,嚴(yán)格控制飲食,。,3.2 研究

6、群體,一般是,健康受試者,。,在特定環(huán)境下，受試藥物表現(xiàn)的治療效果或者藥效學(xué)效果,不在健康者身上出現(xiàn),，此時(shí)要從,患者群體,中招募受試者。,藥物相互作用的程度可能因受試者某個(gè)具體CYP酶的基因型不同而有所差異。,3.3 底物和作用藥物的選擇,表二：指南推薦的CYP酶底物。,“雞尾酒”模式,釋義：在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中受試者同時(shí)服用,多種CYP酶底物,。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需考慮下列因素：,(1)一種特定酶的底物對(duì)該酶具有較高的選擇性;,(2)底物之間沒(méi)有相互作用發(fā)生;,(3)受試者的數(shù)量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。,(4)藥物濃度變化在安全范圍內(nèi);,(5)入選的CYP酶都參與藥物代謝消除;,(6)藥物其他代謝途徑或者不被抑制

7、的途徑的藥物清除率低。,評(píng)價(jià)：,這種雞尾酒實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果可以免除對(duì)其中某個(gè)具體酶的進(jìn)一步評(píng)價(jià),然而,陽(yáng)性結(jié)果則需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究,。,雞尾酒實(shí)驗(yàn)可比單個(gè)相互作用研究提供更多的信息,而結(jié)論的確定程度取決于藥物其他不被抑制的代謝途徑的清除率分?jǐn)?shù)(,清除率分?jǐn)?shù)越小,確定程度越高,)。,如果單一的相互作用實(shí)驗(yàn)顯示抑制效應(yīng)可以導(dǎo)致嚴(yán)重的安全隱患,則不能進(jìn)行雞尾酒設(shè)計(jì)法。,3.4 給藥途徑,受試藥物的給藥途徑應(yīng)與,將來(lái)臨床應(yīng)用,的方式一致。,體內(nèi)相互作用研究采取的給藥方式取決于,未來(lái)上市劑型,。,3.5 給藥劑量,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能將底物和作用藥物相互作用的結(jié)果,最大化,，因此指南推薦作用藥物（抑制劑/誘

8、導(dǎo)劑）使用,最大安全劑量和最短給藥間隔,。,當(dāng)使用,低于,臨床常用劑量的給藥方案時(shí)，體內(nèi)藥物相互作用研究方案應(yīng)在結(jié)果報(bào)告中,進(jìn)行討論,。,4.藥物代謝酶的確認(rèn),如果某個(gè)酶對(duì)藥物的代謝量占整個(gè)藥物消除量,25%,則可以確認(rèn)此酶是藥物的主要代謝酶。,將藥物和肝細(xì)胞或肝切片一起孵育,然后通過(guò)色譜方法分析孵育介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,這種方法可以直接獲得氧化、水解或基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成的代謝物,提供平行代謝還是先后代謝的信息。,另一種方法是用HPLC來(lái)分析孵育介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)還需要優(yōu)化介質(zhì)中受試藥物濃度和孵育時(shí)間。臨床預(yù)期的穩(wěn)態(tài)血藥濃度可以用來(lái)指導(dǎo)體外實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中藥物濃度的選擇。,有三種方法可以很好地確認(rèn)不同的CYP酶對(duì)

9、藥物代謝的貢獻(xiàn):,(1)特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑,表5：,列出了常用的,特異性,化學(xué)抑制劑。,在確定代謝酶種類及其在藥物代謝中的相對(duì)貢獻(xiàn)時(shí),藥物的濃度要,K,m 值,而抑制劑的濃度既要保證其選擇性又要保證足夠的量,所以可以采用一系列的抑制劑濃度。當(dāng)使用基于作用機(jī)制的抑制劑時(shí),最好將抑制劑與酶預(yù)先孵育,15 30 min。,(2)應(yīng)用不同的人重組CYP酶,這種技術(shù)對(duì)研究單個(gè)CYP酶在整個(gè)藥物代謝中的相對(duì)貢獻(xiàn)的大小具有很高的價(jià)值,但不能代表人肝微粒體酶中的絕對(duì)的代謝比率。,(3)根據(jù)不同供體來(lái)源的CYP酶不同活性建立人肝微粒體庫(kù)。,指南建議至少采用上述兩種方法來(lái)確認(rèn)藥物代謝酶,5.C

10、YP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià),Review:,K,i,：抑制率常數(shù)，抑制作用越強(qiáng)，此值越小,IC,50,：反應(yīng)被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度，越低表明抑制劑的抑制能力越強(qiáng)。,5.CYP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià),CYP酶抑制劑體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),注意事項(xiàng),:,(1)IC,50,測(cè)定時(shí),在底物代謝率允許的情況下,盡量使底物的濃度低于其,K,m 值,使IC,50,與其,K,i 值更具相關(guān)性;,(2)肝微粒體蛋白濃度通常 1 gL,-1,;,(3)緩沖液的性質(zhì)、pH對(duì)Vmax和,K,m 的影響顯著,盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)化的分析條件;,(4)反應(yīng)系統(tǒng)中最好控制底物或抑制劑的消耗不超過(guò)10%30%,但是對(duì)于,K,m 值很低的藥物來(lái)

11、說(shuō),控制反應(yīng)體系底物消耗10%很困難;,(5)建議建立時(shí)間-產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系;,(6)建議建立酶量-產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系;,(7)因?yàn)槟承┯袡C(jī)溶劑具有酶誘導(dǎo)或抑制作用,溶劑的濃度都要 1%(v/v),最好 0.1%,實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括無(wú)溶劑對(duì)照和溶劑對(duì)照;,(8)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有一個(gè)已知抑制劑的陽(yáng)性對(duì)照。,相互作用程度的模擬：,R=1+I/,K,i,（I代表作用部位抑制劑的濃度,K,i 是抑制常數(shù)）,指南推薦體內(nèi)相互作用的可能性通過(guò),I/,K,i,來(lái)推斷,I代表服用臨床最大用藥量后平均穩(wěn)態(tài)的藥物濃度(游離或結(jié)合的全部藥物),比值升高,產(chǎn)生相互作用的可能性增大。,盡管通過(guò)體外數(shù)據(jù)定量預(yù)測(cè)體內(nèi)相互作用發(fā)生的

12、可能性存在困難,但可以通過(guò),同一個(gè)藥物,對(duì)不同CYP 酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、CYP2D6和CYP3A)的,K,i 值進(jìn)行篩選排序,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從,I/,K,i,最大者,(或者,K,i,最小者)的CYP酶開(kāi)始,如果實(shí)驗(yàn)顯示體內(nèi),不存在,藥物相互作用,其他的,I/,K,i,相對(duì)較小的CYP酶的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)就可以,不做,。,6.CYP酶誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)包括一個(gè)公認(rèn)的酶誘導(dǎo)劑作為陽(yáng)性對(duì)照,來(lái)減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。,表7:誘導(dǎo)劑選擇列表,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：,(1)受試藥物的濃度應(yīng)該參考臨床治療劑量的血藥濃度,至少包括3個(gè)涵蓋治療窗的篩選濃度,其

13、中至少1個(gè)濃度要超過(guò)平均預(yù)期治療濃度1個(gè)數(shù)量級(jí);,(2)與肝細(xì)胞共孵育23 d后,通過(guò)CYP特異的探針?biāo)幬?參考指南推薦)測(cè)定酶活性;,(3)使用新鮮分離的或者凍存的肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)該至少選擇3份不同的供體以減少誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中存在的個(gè)體差異。,評(píng)價(jià),藥物酶誘導(dǎo),作用時(shí),指南建議:,(1)藥物體外實(shí)驗(yàn)引起的酶活性的改變,40%陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果時(shí),可以認(rèn)為藥物具有酶誘導(dǎo)作用,需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究;,(2)EC,50,可以用來(lái)比較不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)能 力的強(qiáng)弱;,(3)指南認(rèn)為,根據(jù)目前了解的CYP酶誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,如果一個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示對(duì),CYP3A4,酶沒(méi)有誘導(dǎo)作用,可以推斷此藥物對(duì)CYP2C8,CYP

14、2C9和CYP2C19也,沒(méi)有,誘導(dǎo)作用。,7.P-gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究,考察藥物是否是P-gp的底物或抑制劑,最常見(jiàn)的方法有哪些？,雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定法,由于更直接,因此被作為標(biāo)準(zhǔn)的方法。,ATP酶活性測(cè)定法和攝取/外排法,可以用于快速篩選,但是不能區(qū)分是底物還是抑制劑。如果藥物透過(guò)性(膜擴(kuò)散能力)低,ATP酶法和熒光定量法常常無(wú)法識(shí)別是否是P-gp的底物。,對(duì)高通透性化合物,雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定法,也不適用。,這些底物作為陽(yáng)性對(duì)照，保證實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞能夠表達(dá)功能性的P-gp.,7,.,1,雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)確定藥物是否是P-gp的底物,選擇好細(xì)胞系和P-gp底物陽(yáng)性對(duì)照后,遵循下列步驟完成實(shí)驗(yàn):,(1)

15、設(shè)計(jì)幾個(gè)不同的藥物濃度(如1,10,100molL-1)考察P-gp 對(duì)藥物的外排作用;,(2)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將極性細(xì)胞組成的膜兩側(cè)的介質(zhì)去掉,加入新的介質(zhì)并孵育30 min;,(3)進(jìn)行雙向膜轉(zhuǎn)運(yùn)通透性研究:在極性膜的A側(cè)(apical側(cè),腔側(cè),頂區(qū)側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)方向是A B)或B 側(cè)(basolateral側(cè),基底側(cè),轉(zhuǎn)運(yùn)方向是B A)加入適量體積的含有已知P-gp底物或受試藥物的緩沖液;,(4)在37C孵育,在預(yù)定的時(shí)間(通常是1,2,3,4 h)收集受側(cè)的介質(zhì)測(cè)定藥物濃度,同時(shí)迅速補(bǔ)充緩沖液;,(5)已知P-gp底物作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn);,(6)當(dāng)采用LLC2PK1-MDR1 MDCK-

16、MDR1 作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系時(shí),相應(yīng)的野生型細(xì)胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對(duì)照;,(7)每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在不同日期重復(fù)3次,考察日間和日內(nèi)變異情況;,(8)理想的實(shí)驗(yàn)還應(yīng)該測(cè)定底物的回收率,來(lái)消藥物代謝和非特異性結(jié)合帶來(lái)的誤差,由于Caco-2、野生型的LLC-PK1和MDCK也能表達(dá)其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因此在評(píng)價(jià)藥物是否是P-gp底物時(shí)要謹(jǐn)慎,為增加實(shí)驗(yàn)的可信性,建議增加P-gp抑制劑(表10)存在下的底物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),如果藥物的外排可被P-gp抑制劑明顯抑制,則說(shuō)明藥物的外排與P-gp有關(guān)。,指南還建議,可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比MDR1過(guò)度表達(dá)細(xì)胞(轉(zhuǎn)染型細(xì)胞)和它們的野生型細(xì)胞對(duì)藥物外排活性的差異,確定P-gp在藥物外排中的貢獻(xiàn)大小。,利用下列公式描述藥物跨膜表觀通透性:,P,app=(,V,r/,c,0,)(1/,S,)(d,c,/d,t,),其中,V,r是極性膜受側(cè)介質(zhì)體積,c,0,是指膜供側(cè)實(shí)驗(yàn)藥物的濃度,S,是指極性細(xì)胞形成的膜的面積,d,c,/d,t,是受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時(shí)間曲線的斜率。準(zhǔn)確計(jì)算,P,app必須要求受側(cè)藥物濃度與時(shí)間是直線關(guān)系。,藥物經(jīng)P-gp外排速率,R,E可以通過(guò)