碩士研究生開題報(bào)告p16在宮頸癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的研究課件

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),廣東醫(yī)學(xué)院2003級(jí),碩士研究生開題報(bào)告,廣東醫(yī)學(xué)院2003級(jí)碩士研究生開題報(bào)告,1,p16在宮頸癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的研究,研究生：鄧飛,導(dǎo)師：胡新榮 教授,時(shí)間：2004年10月22日,p16在宮頸癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的研究,2,立題依據(jù),立題依據(jù),3,腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的長期過程，其中多個(gè)基因的改變導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)，細(xì)胞增殖失控在腫瘤形成的過程中發(fā)揮了重要作用。,p16基因又稱MTS1（多腫瘤抑制基因）是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞分裂的基因。,p16在諸多腫瘤中的改變

2、，使它在腫瘤發(fā)生中的作用日益受到人們的重視。,腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的長期過程，其中多個(gè)基因的改變,4,一、p16的基因結(jié)構(gòu)和功能,一、p16的基因結(jié)構(gòu)和功能,5,1、p16的基因結(jié)構(gòu),p16基因定位于9p21，全長8.5kb，由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，三個(gè)外顯子的長度分別為126、307、11bp，其cDNA全長450bp。p16基因啟動(dòng)子和外顯子1、2含有多個(gè)可甲基化的5CpG島。,p16基因編碼產(chǎn)物p16蛋白，由148個(gè)氨基酸構(gòu)成，為16kd,1、p16的基因結(jié)構(gòu) p16基因定位于9p21，全長8.5k,6,2、p16的功能,RB,E2F,RB,P,P,P,P,E2F,INK

3、4A,p16,cyclinD1,CDK4/6,P,CDK,cyclinD1,CDK4/6,cyclinD1,CDK4/6,CDK4/6,P,競爭性抑制,2、p16的功能RBE2FRBPPPPE2FINK4Ap16,7,二、p16與腫瘤,二、p16與腫瘤,8,研究表明，p16基因的缺失、突變和甲基化存在于多種人腫瘤細(xì)胞，提示其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。,研究表明，p16基因的缺失、突變和甲基化存在于多種人腫瘤細(xì)胞,9,p16除了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞異常增殖以外，還與腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞的永生化有關(guān)。,p16除了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞異常增殖以外，還與腫瘤細(xì)胞中,10,大

4、量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)使人們相信在大多數(shù)腫瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。,大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)使人們相信在大多數(shù)腫瘤中p16扮演者抑癌基因的,11,三、p16與宮頸癌,三、p16與宮頸癌,12,宮頸癌是婦女常見腫瘤之一，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。對于p16與宮頸癌關(guān)系的研究，已成為近幾年來宮頸癌發(fā)生機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。,宮頸癌是婦女常見腫瘤之一，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。對于p16與宮,13,同在大多數(shù)腫瘤中一樣。p16基因也被認(rèn)為在宮頸癌發(fā)生中的扮演著抑癌基因的角色，其主要依據(jù)有：,1、宮頸腫瘤組織中，普遍都能檢測到p16基因的失活。,2、p16基因及其編碼蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中能抑制宮頸癌細(xì)胞系的生長。,同在大多數(shù)腫瘤中一

5、樣。p16基因也被認(rèn)為在宮頸癌發(fā)生中的扮演,14,然而，在對p16的進(jìn)一步研究中，人們用免疫組化檢測臨床病例標(biāo)本的p16蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，p16蛋白的表達(dá)會(huì)隨著宮頸癌病情的進(jìn)展而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。,然而，在對p16的進(jìn)一步研究中，人們用免疫組化檢測臨床病例標(biāo),15,這一發(fā)現(xiàn)使人們對p16在宮頸癌發(fā)生中的作用產(chǎn)生了疑問：,（1）p16在宮頸癌發(fā)生過程中起什么作用，是否與在其他腫瘤中一樣起著抑癌作用。,（2）如果p16是抑癌基因，為什么其失活率隨宮頸癌的發(fā)生而逐漸增加的同時(shí)，表達(dá)也逐漸升高。,這一發(fā)現(xiàn)使人們對p16在宮頸癌發(fā)生中的作用產(chǎn)生了疑問：,16,以上問題迄今為止，都還沒有得到滿意合理的解釋

6、，國內(nèi)也缺乏此類相關(guān)研究。本實(shí)這些驗(yàn)即是針對以上問題展開初步的探討。,以上問題迄今為止，都還沒有得到滿意合理的解釋，國內(nèi)也缺乏此類,17,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?18,1、研究p16在宮頸癌的發(fā)生過程的表達(dá)趨勢。,2、研究p16在宮頸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制。,1、研究p16在宮頸癌的發(fā)生過程的表達(dá)趨勢。,19,擬解決的關(guān)鍵問題,擬解決的關(guān)鍵問題,20,1、p16在宮頸癌發(fā)生過程中表達(dá)是否升高。,2、高表達(dá)的p16與cyclinD1競爭性結(jié)合CDK4/6的能力是否改變。,3、p16高表達(dá)與pRb磷酸化的關(guān)系。,4、體外實(shí)驗(yàn)中p16表達(dá)對cyclinD1與CDK4/6的結(jié)合能力及pRb的磷酸化水平的影響

7、。,1、p16在宮頸癌發(fā)生過程中表達(dá)是否升高。,21,擬采取的研究方法,擬采取的研究方法,22,（1）IHC,（2）CO-IP、IP、western-blot,（3）siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系,（1）IHC,23,技術(shù)路線,技術(shù)路線,24,一、臨床實(shí)驗(yàn),一、臨床實(shí)驗(yàn),25,1、p16表達(dá)的檢測：,臨,床,病,例,標(biāo),本,切片、HE,同一組織來源,不同組織來源,癌前病變,宮頸癌,癌前病變,宮頸癌,p16,P16,的,表,達(dá),趨,勢,圖像,分析,IHC,1、p16表達(dá)的檢測：臨切片、HE同一組織來源不同組織來源癌,26,2、p16功能檢測,p16,高表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本,P16,低表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本,提

8、取組織塊,中的蛋白質(zhì),p16-CDK4/6,pRb-P,對比不同組結(jié)果，,研究,p16,表達(dá)與,pRb,磷酸化的關(guān)系,對比不同組的,結(jié)果，研究p16,表達(dá)升高對其,功能的影響。,CO-IP、,western,IP,western,2、p16功能檢測p16高表達(dá)的宮頸癌標(biāo)本 P16低表達(dá)的宮,27,二、體外實(shí)驗(yàn),二、體外實(shí)驗(yàn),28,p16高表達(dá)的,宮頸癌細(xì)胞,篩選,p16表達(dá)缺失的,宮頸癌細(xì)胞,CyclinD1-CDK4/6,pRb-P,CyclinD1-CDK4/6,pRb-P,CO-IP、IP、western-blot,對比分析,得出結(jié)論,siRNA,腺病毒轉(zhuǎn)染,p16高表達(dá)的篩選p16表達(dá)

9、缺失的CyclinD1-CDK4,29,預(yù)期結(jié)果,預(yù)期結(jié)果,30,1、p16在宮頸癌的發(fā)生過程中表達(dá)逐漸升高。,2、臨床實(shí)驗(yàn)中，p16高表達(dá)組比低表達(dá)組，p16與CDK4/6的結(jié)合增加，pRb的磷酸化水平升高。,3、體外實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染前后，cyclinD1與CDK4/6的結(jié)合增加，pRb的磷酸化水平降低，,1、p16在宮頸癌的發(fā)生過程中表達(dá)逐漸升高。,31,進(jìn)度安排,進(jìn)度安排,32,2004.102005.7 臨床病理標(biāo)本的收集。細(xì)胞系的篩選，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后篩選。,2005.82006.1 IHC、CO-IP、IP、western-blot。,2006.22006.4 結(jié)果分析，撰寫論文，準(zhǔn)備答辯。,2004.102005.7 臨床病理標(biāo)本的收集。細(xì)胞系的篩,33,經(jīng)費(fèi)預(yù)算,經(jīng)費(fèi)預(yù)算,34,免疫組化 2000元,免疫沉淀 5000元,Western-blot 3000元,細(xì)胞培養(yǎng) 2000元,siRNA轉(zhuǎn)染 25000元*,總計(jì) 37000元,免疫組化 2000元,35,請老師同學(xué)多提寶貴意見,請老師同學(xué)多提寶貴意見,36,