臨床檢驗(yàn)中的發(fā)光免疫分析講解

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,臨床檢驗(yàn)中的發(fā)光免疫分析原理、優(yōu)勢(shì)和值得留意的問題,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部爭(zhēng)論員,中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)光生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任委員,國(guó)際生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光學(xué)會(huì)(ISBC學(xué)術(shù)理事,Council member of scientific advisory board of,International Society on Bioluminescence&Chemiluminescence,楊曉林,由于化學(xué)反響通常是氧化或生物化學(xué)反響產(chǎn)生電子能級(jí)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者通過躍遷釋放能量并產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象。與熒光最

2、大的區(qū)分在于無需激發(fā)光，因此后者也被稱為光致發(fā)光。,發(fā)光Luminescence化學(xué)發(fā)光Chemiluminescence生物發(fā)光Bioluminescence,生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光均屬于冷光，即發(fā)光不是由于發(fā)光體溫度上升所致，因此其反響能量絕大局部用于發(fā)光而不是發(fā)熱，放射波長(zhǎng)也與溫度無關(guān)。,發(fā)光測(cè)定屬放射光譜分析，多承受動(dòng)力/速率法或積分法，無需終止反響，也不受朗伯-比爾定律限制；,而酶標(biāo)顯色測(cè)定屬吸取光譜分析，多承受終點(diǎn)法，需終止反響，并受朗伯-比爾定律限制。,按化學(xué)反響類型,化學(xué)發(fā)光的分類,酶促化學(xué)發(fā)光：,辣根過氧化物酶系統(tǒng),堿性磷酸酶系統(tǒng),黃嘌呤氧化酶系統(tǒng),非酶促化學(xué)發(fā)光：,吖啶酯系統(tǒng),

3、草酸酯系統(tǒng),三價(jià)鐵-魯米諾系統(tǒng),閃光Flash:,按發(fā)光持續(xù)時(shí)間,發(fā)光時(shí)間在數(shù)特別鐘以上，如：,HRP-Luminol系統(tǒng),AP-AMPPD系統(tǒng),黃嘌呤氧化酶系統(tǒng),無須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。,發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯,以原位進(jìn)樣(In Situ Injector)和時(shí)間積分法測(cè)量,輝光Glow:,時(shí)間,發(fā)光信號(hào),輝光坪區(qū),速率法測(cè)量,原位進(jìn)樣,積分法測(cè)量,閃光尖峰,閃光與輝光及其測(cè)量方式的差異,魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),H,2,O,2,+,NH,2,O,O,NH,NH,N,2,OH,-,HRP,NH,2,CO,2,-,CO,2,-,+Photon(425nm),R,OH,R,OH

4、,N,S,R,B,OH,OH,增強(qiáng)劑,（Enhancer）,商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)一,AMPPD及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),+,*,光子(477nm),AP,O,O,OCH,3,OPO,3,2-,O,-,O,O,OCH,3,O,O,-,O,OCH,3,商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)二,CH,3,C=O,O,R,N,+,OH,-,H,+,H,2,O,2,+H,2,O,+,R,OH,光子+CO,2,+,CH,3,C=O,O,R,N,HO,CH,3,C=O,O,R,N,HOO,CH,3,O,N,CH,3,O,N,C=O,O,商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)三,吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),發(fā)光檢測(cè)的劑量-

5、反響關(guān)系曲線,信號(hào)強(qiáng)度Y,實(shí)際曲線,標(biāo)記物濃度X,理論/校正曲線,由于：不同發(fā)光體系和免疫分析模式具有不同的實(shí)際信號(hào)曲線,因此：科學(xué)準(zhǔn)確的特定校正技術(shù)是衡量設(shè)備和試劑匹配性的關(guān)鍵,發(fā)光信號(hào)檢測(cè),光敏二極管、光敏電池、光電偶合器CCD,構(gòu)造簡(jiǎn)潔、性能穩(wěn)定,但靈敏度低、線性范圍較窄。,主要特點(diǎn),原理：,光信號(hào),光電轉(zhuǎn)換器件,電壓或電流信號(hào),放大,單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度,發(fā)光的核心部件,光電倍增管,高壓,高速放大器,高速比較器,高速分頻器,發(fā)光樣品,產(chǎn)生光子,激發(fā)光陰極,產(chǎn)生光電子,在陽極上形成較強(qiáng)信號(hào),脈沖信號(hào),相對(duì)發(fā)光單位,數(shù)字脈沖(RLU),在各打拿極之間得到,能量和數(shù)目的倍增,單光子計(jì)數(shù)

6、器的工作特性,光子計(jì)數(shù)Y,發(fā)光強(qiáng)度X,飽和點(diǎn),理論/校正曲線,實(shí)際計(jì)數(shù)曲線,由于：?jiǎn)喂庾佑?jì)數(shù)是在檢測(cè)隨機(jī)光子大事,因此：隨光子數(shù)量增多檢測(cè)效率持續(xù)下降,所以：準(zhǔn)確的校正技術(shù)是設(shè)備品質(zhì)的關(guān)鍵,模擬光電流測(cè)量曲線,單光子計(jì)數(shù)式發(fā)光檢測(cè)儀,計(jì),算,機(jī),打,印,機(jī),發(fā)光儀掌握模塊,發(fā)光儀執(zhí)行模塊,掌握器,程控高壓,計(jì)數(shù)/貯存器,單光子計(jì)數(shù)器,樣品運(yùn)動(dòng)/定位裝置,程控自動(dòng)門鎖及檢測(cè)裝置,原位注射泵,光生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍,軍事偵測(cè),公安稽查,衛(wèi)生檢疫,藥物篩查,醫(yī)學(xué)診斷,環(huán)境檢測(cè),航天遙感,生命科學(xué),已成為現(xiàn)代生物技術(shù)最活潑的領(lǐng)域之一,光生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)越性,徹底消退了放射性危害,無半衰期限制，試劑穩(wěn)

7、定性和有效期大大延長(zhǎng),簡(jiǎn)潔實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測(cè)定,適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)展多指標(biāo)并行測(cè)定,操作簡(jiǎn)潔，反響速度快，簡(jiǎn)潔實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,靈敏度和線性范圍超過以往技術(shù),幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)理論極限靈敏度的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,靈敏度(mol/L),10,-18,10,-15,10,-12,10,-9,幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)理論線性范圍的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,線性范圍,10,5,10,4,10,3,10,2,幾種標(biāo)記/檢測(cè)試劑的有效期比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,有效期月,18,15,12,9,6,3,0,0,20,000,40,000,60,000,80,000,100,000,試劑盒,儀器,

8、特殊防護(hù),治理污染,人民幣,人民幣,三種免疫測(cè)定技術(shù)的本錢及費(fèi)用,三種免疫測(cè)定技術(shù)的本錢及費(fèi)用,放免,酶標(biāo),發(fā)光,夾心法的劑量-反響關(guān)系曲線,信號(hào)強(qiáng)度Y,線性范圍,待測(cè)物濃度X,Hook(前滯,)效應(yīng),分析靈敏度最低檢測(cè)限95%可信度：,S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。,功能靈敏度：,測(cè)定誤差變異20%的最低可檢測(cè)濃度。,線性范圍：,分析功能靈敏度-變異20%的最高檢測(cè)濃度,相關(guān)系數(shù)0.99的曲線范圍,競(jìng)爭(zhēng)法的劑量-反響關(guān)系曲線,待測(cè)物濃度 X,信號(hào)強(qiáng)度 Y,線性范圍,分析靈敏度最低檢測(cè)限95%可信度：,S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值,功能靈敏度：,測(cè)定誤差變異20%的最低可檢測(cè)濃

9、度,線性范圍：,分析功能靈敏度-變異20%的最高檢測(cè)濃度,相關(guān)系數(shù)0.99的曲線范圍,發(fā)光免疫分析技術(shù),的現(xiàn)狀及應(yīng)留意的問題,商品化光生物學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)性能比較,技術(shù)類型,標(biāo)記、反應(yīng)體系,主要優(yōu)點(diǎn),主要不足,化,學(xué),發(fā),光,酶促,過氧化物酶、魯米諾、氧化劑、增強(qiáng)劑等,測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）成本較低、靈敏度較高,工作曲線隨時(shí)間漂移低端斜率呈非線性下移,螺旋金剛烷環(huán)氧化物、堿性磷酸酶,測(cè)量方式簡(jiǎn)單（速率法）靈敏度較高,非酶促,吖啶酯、過氧化氫,靈敏度較高,試劑成本高、發(fā)光時(shí)間短測(cè)量方式復(fù)雜（積分法）需原位進(jìn)樣(In Situ Injector)儀器成本及維護(hù)費(fèi)用較高試劑成本較高,時(shí)間分辨熒光,銪（

10、Eu）、鏑(Dy)、釤（Sm）、鋱（Tb）、等絡(luò)合物脈沖光源激發(fā),靈敏度較高、試劑較穩(wěn)定,測(cè)量方式復(fù)雜（脈沖激發(fā)、間歇式測(cè)量、流動(dòng)池）儀器成本及維護(hù)費(fèi)用高環(huán)境及樣品中同類元素可導(dǎo)致本底干擾,電化學(xué)發(fā)光,釕(Ru)的絡(luò)合物脈沖電場(chǎng)激發(fā),化學(xué)發(fā)光：Chemiluminescence,時(shí)間區(qū)分熒光也稱時(shí)間延遲光致發(fā)光Time Resolved FluorescenceTime Delayed Photoluminescence,標(biāo)記物為稀土元素絡(luò)合物，通常承受解離增加熒光免疫分析DEFIA,電化學(xué)發(fā)光也稱場(chǎng)致發(fā)光ElectrochemiluminescenceElectroluminescence標(biāo)

11、記物為稀土元素絡(luò)合物,例如：電化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.005mIU/L,第四代化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.001mIU/L,緣由在于抗體的親合力，而不是檢測(cè)技術(shù)。,抗體篩選、干擾屏蔽，生產(chǎn)工藝、治理水平和技術(shù)效勞是打算產(chǎn)品性能的關(guān)鍵,某些產(chǎn)品宣稱的靈敏度遠(yuǎn)超過免疫反響的理論極限10-19mol/L,即：六個(gè)待測(cè)物分子/100ul樣品,就發(fā)光分析而言，制約靈敏度的瓶頸在于抗體親合力和干擾因素，而不是檢測(cè)技術(shù)。,所以，片面宣揚(yáng)檢測(cè)技術(shù)靈敏度和線性范圍的強(qiáng)弱，不僅毫無意義，而且也是荒唐的。,商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的某些宣傳誤區(qū),C肽,胰,島,素,免疫源性胰島素,胰,島,素

12、,胰島素原,真胰島素,胰島素,針對(duì)掩蔽性抗原,抗體選擇胰島素,多抗或無選擇性單抗,亞,單,位,亞,單,位,亞,單,位,一般HCG,亞,單,位,HCG,亞,單,位,亞,單,位,HCG游離亞單位,亞,單,位,X,抗體選擇HCG,(TSH、PRL、LH、FSH類似),多抗或無選擇性單抗,針對(duì)掩蔽性抗原,亞單位特異,亞單位特異,亞單位特異,亞單位特異,結(jié)合蛋白,PSA,總PSA,PSA,游離PSA,抗體選擇游離PSA,針對(duì)掩蔽性抗原,針對(duì)非掩蔽性抗原,與結(jié)合和游離,PSA,等分子結(jié)合,小分子性激素測(cè)定方法的進(jìn)展,削減,結(jié)合蛋白,類似物,前體,代謝產(chǎn)物,干擾,直接測(cè)定法,經(jīng)典方法,消化樣品,萃取有機(jī)相,

13、分子篩柱分別各類甾體,測(cè)定,血清直接測(cè)定,+,高特異性單抗,+,結(jié)合蛋白屏蔽技術(shù),男女性激素和皮質(zhì)激素均來源于共同的前體和合成、代謝途徑，其構(gòu)造也特別相像；而且普遍與血清中的某些蛋白結(jié)合。,因此，皮質(zhì)功能紊亂、肝腎功能紊亂、某些遺傳缺陷、血清蛋白特別、服用類固醇藥物等均可造成這些激素測(cè)定結(jié)果的特別。,游離甲狀腺激素測(cè)定方法的進(jìn)展,常見甲功指標(biāo)：,TSH、FT,3,、FT,4,、TT,3,、TT,4,對(duì)甲亢的診斷價(jià)值依次為：,TSH=FT,3,FT,4,TT,3,TT,4,對(duì)甲低的診斷價(jià)值依次為：,FT,4,=TSHTT,4,FT,3,TT,3,但FT,3,、FT,4,靈敏度要求高，且易受干擾,

14、發(fā)光法提高了靈敏度，使得其臨床應(yīng)用普遍性超過TT,4,和TT,3,兩步法,操作時(shí)間長(zhǎng),靈敏度差,準(zhǔn)確性差,類似物法,操作時(shí)間短,靈敏度較好,準(zhǔn)確性較好,反向競(jìng)爭(zhēng)法,標(biāo)記抗體,操作時(shí)間短,靈敏度更好,準(zhǔn)確性更好,第一代放免,其次代,第三代,血清FT3、FT4試劑盒的進(jìn)展,消退結(jié)合蛋白對(duì)測(cè)定的影響,測(cè)定游離激素的參考方法“金”標(biāo)準(zhǔn)：平衡透析法透析液過多可導(dǎo)致測(cè)值偏高,操作簡(jiǎn)單、采樣量大，不適于臨床常規(guī),游離激素測(cè)定法的試金石稀釋試驗(yàn),以游離T4為例,樣品稀釋20倍以內(nèi)測(cè)值無明顯變化,應(yīng)扣除試驗(yàn)本身對(duì)樣品的稀釋度并留意基質(zhì)效應(yīng),建議用6-8%BSA稀釋,FT,4,+TBG,K,T,4,TBG,游離

15、T,4,游離結(jié)合蛋白,結(jié)合常數(shù),結(jié)合T,4,其中：K=,由于絕大局部T4呈結(jié)合狀態(tài)，因此：T4TBGTT4(總T4);TBG總TBGTT4,故，K,所以，樣品被稀釋N倍后，,T,4,TBG,FT,4,TBG,TT,4,FT,4,(,總TBGTT,4,),(固定常數(shù)，不變),TT,4,K,(,總TBGTT,4,),TT,4,/N,K,(,總TBG,/N,TT,4,/N,),FT,4,=,TT,4,/N,K,(,總TBGTT,4,),/N,=,TT,4,K,(,總TBGTT,4,),相 同,即，F(xiàn)T,4,發(fā)光技術(shù),臨床免疫分析劃時(shí)代的進(jìn)步,以TSH(促甲狀腺素)為例,第一代,TSH檢測(cè)試劑盒,一般

16、放免,功能靈敏度1-2mIU/L,根本無法測(cè)到正常值,下限以下的血清TSH,對(duì)甲亢的診斷意義不大,固相放免,功能靈敏度,在甲亢的診斷中,開頭發(fā)揮作用,其次代,TSH檢測(cè)試劑盒,發(fā)光免疫,功能靈敏度,成為甲亢診斷的,首選指標(biāo)之一,新型發(fā)光免疫,功能靈敏度,更新了局部臨床概念,改寫了甲功的調(diào)控理論,第三代,TSH檢測(cè)試劑盒,第四代,TSH檢測(cè)試劑盒,目前商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的幾個(gè)特點(diǎn),大多承受全自開工作方式，局部承受微孔板半自動(dòng)方式,多承受磁性或非磁性微粒包被，以增加外表積，使反響時(shí)間縮短,使用內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線加校正的方法產(chǎn)生工作曲線,局部產(chǎn)品承受流淌池測(cè)定方式(適合于閃光型發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光),流淌池檢測(cè)方式示意圖,檢測(cè)器,檢測(cè)池,負(fù)壓泵,廢液,四通閥,沖洗液,樣品管,計(jì)量泵,枯燥空氣,原位進(jìn)樣泵,氧化劑,優(yōu)點(diǎn)：構(gòu)造簡(jiǎn)潔，運(yùn)行本錢低,缺點(diǎn)：易產(chǎn)生穿插污染，工作效率受限,標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)對(duì)試劑盒的技術(shù)要求,對(duì)儀器的要求：構(gòu)造簡(jiǎn)潔、運(yùn)行效率高、故障率低、維護(hù)費(fèi)用少,對(duì)試劑盒的相應(yīng)要求：標(biāo)準(zhǔn)化、成套化、簡(jiǎn)潔化，具體為：,反響/洗滌/測(cè)定條件全都；操作步驟少且趨于全都,反響時(shí)間短；通用成分多