動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)新醫(yī)學(xué)PPT

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動(dòng)物細(xì)胞融合,單克隆抗體技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞核移植,（基礎(chǔ)）,在治療燒傷病人時(shí)，通常采用的方法是取燒傷病人健康皮膚進(jìn)行自體移植。但對(duì)于一個(gè)大面積燒傷的病人來(lái)說(shuō)，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來(lái)源不足，而且會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),那么，怎么才能獲得大量的自體健康皮膚呢？,1、概念：,就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。,2、原理：細(xì)胞增殖,（有絲分裂）,概念：人們通常將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。,胰蛋白酶/膠原蛋白酶處理,取出組織塊,胚胎或幼齡動(dòng)物器官組織,,剪碎,單個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞懸液,,,,①原代培養(yǎng),,細(xì)胞懸液,,,,CO2培養(yǎng)箱,增殖能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng),3.過(guò)程,加培養(yǎng)液,特點(diǎn)： ①細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)成單層細(xì)胞； ②有接觸抑制現(xiàn)象；,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng),貼壁過(guò)程,細(xì)胞貼壁：,培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：,內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、無(wú)菌、易于貼附,在培養(yǎng)瓶懸液中分散培養(yǎng)的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱(chēng)為細(xì)胞貼壁。,①原代培養(yǎng)特點(diǎn),當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為細(xì)胞的接觸抑制。,細(xì)胞的接觸抑制,①原代培養(yǎng)特點(diǎn),接觸抑制：,,②傳代培養(yǎng)（擴(kuò)大培養(yǎng)）,CO2培養(yǎng)箱,當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后, 用胰蛋白酶處理,使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來(lái),然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),這個(gè)過(guò)程稱(chēng)傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過(guò)程）,分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)： 以1:2或l:3以上的比率進(jìn)行分裝,,10—50代細(xì)胞,無(wú)限傳代,分瓶,胰蛋白酶,原代培養(yǎng)接觸抑制,,1—10代細(xì)胞,,,,傳代培養(yǎng),單層細(xì)胞,細(xì)胞核型保持正常,多層細(xì)胞,細(xì)胞突變核型改變,①第 一次危機(jī),②第 二次危機(jī),部分細(xì)胞核型可能改變,癌細(xì)胞（不死性，無(wú)限增殖，失去接觸抑制，易轉(zhuǎn)移）,②傳代培養(yǎng)特點(diǎn),單層細(xì)胞,,每分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一次為一次傳代；傳代代數(shù)就是分瓶次數(shù)； 每一代的細(xì)胞培養(yǎng)，從細(xì)胞貼壁到貼滿(mǎn)瓶壁過(guò)程中，細(xì)胞分裂了很多次；,思考題,傳代培養(yǎng)中,傳代代/次數(shù)與細(xì)胞增殖/分裂次數(shù)是否相同？,,1.為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的呢？,成塊的組織細(xì)胞靠在一起,彼此限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，也不利于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝廢物的排出。,思考題,2.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)是什么成份？能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？胰蛋白酶真的不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？,①胰蛋白酶水解蛋白質(zhì),②細(xì)胞間的成分是蛋白質(zhì),③不能，因?yàn)閮烧叩淖钸mpH不同,④胰蛋白酶長(zhǎng)時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白，因此必須控制好胰蛋白酶的處理時(shí)間。,4.傳代培養(yǎng)的細(xì)胞能一直傳代下去嗎？,5.有些為何能一直傳下去？,不都能。傳代培養(yǎng)到50代左右的時(shí)候，大部分的細(xì)胞都停止分裂，最終衰老死亡；但有少數(shù)細(xì)胞能夠繼續(xù)傳代。,這些發(fā)生突變，獲得不死性，朝著癌細(xì)胞方向發(fā)展（成為了癌變細(xì)胞）,3.如果培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量并未達(dá)到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？,用胰蛋白酶處理將貼滿(mǎn)瓶壁的細(xì)胞分離下來(lái)，然后分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)）,8.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)出新個(gè)體？,不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能形成新的動(dòng)物個(gè)體,7.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是為了得到這些細(xì)胞嗎？,可以得到細(xì)胞，也可以得到細(xì)胞產(chǎn)物,6.人類(lèi)一般保存的是哪類(lèi)細(xì)胞呢？為什么？,保存10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，可以保持細(xì)胞正常的二倍體核型；而10代以后的細(xì)胞核型可能發(fā)生變化，有少部分還發(fā)生突變向癌細(xì)胞方向發(fā)展,4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件,1.無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境,①對(duì)培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理； ②在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素； ③定期更換培養(yǎng)液；,2.營(yíng)養(yǎng),葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、促生長(zhǎng)因子、微量元素等,+ 動(dòng)物血清或血漿,3.溫度和pH,溫度36.5±0.5度，pH7.2～7.4,4.氣體環(huán)境,95%空氣和5% CO2（CO2培養(yǎng)箱提供）,合成培養(yǎng)基,不能用胃蛋白酶代替胰蛋白酶,O2是細(xì)胞代謝所必需的；,CO2維持培養(yǎng)液的pH,獲得細(xì)胞,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)品,新的個(gè)體或細(xì)胞產(chǎn)品,培養(yǎng)結(jié)果,或細(xì)胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等,培養(yǎng)目的,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原 理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,葡萄糖等、,動(dòng)物血清,5.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:,1.生產(chǎn)生物制品 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 2.應(yīng)用于基因工程 主要用于作為受體細(xì)胞 3.檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 4.細(xì)胞的生理、藥理、病理研究 如用于篩選抗癌藥物,1.用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的組織和細(xì)胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細(xì)胞（ ?。? A.容易產(chǎn)生各種變異 B.具有更強(qiáng)的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力強(qiáng),【隨堂練習(xí)】,D,2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)（ ） ①細(xì)胞貼壁 ②有絲分裂 ③細(xì)胞分化 ④接觸抑制 ⑤減數(shù)分裂 ⑥原代培養(yǎng)一般傳代1~~10代 A、①②④⑥ B、②③④⑤ C、①③④⑥ D、③④⑤⑥,A,3.下列屬于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)主要區(qū)別的是（ ） A.培養(yǎng)基成分不同 B.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無(wú)菌條件下進(jìn)行 C.動(dòng)物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能 D.動(dòng)物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株,A,C項(xiàng)：愈傷組織條件適宜可以傳代培養(yǎng)不分化（擴(kuò)大培養(yǎng)） D項(xiàng)：正因?yàn)镃項(xiàng)，因此植物細(xì)胞也可以培養(yǎng)成大量細(xì)胞,4.回答下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題： （1）在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到細(xì)胞表面 時(shí)，細(xì)胞會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為細(xì)胞的 。此時(shí)，瓶壁上形成的細(xì)胞層數(shù)是 。要使貼壁的細(xì)胞從瓶壁上分離下來(lái)，需要用酶處理，可用的是 。 （2）隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細(xì)胞分裂停止，進(jìn)而出現(xiàn) 的現(xiàn)象；但極少數(shù)細(xì)胞可以連續(xù)增殖，這些細(xì)胞因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成 細(xì)胞，該種細(xì)胞的黏著性 ，細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)（糖蛋白）的量 。,相互接觸,接觸抑制,單層,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性/癌,降低,減少,（3）檢查某種毒物是否能改變細(xì)胞染色體的數(shù)目，最好選用細(xì)胞分裂到 期的細(xì)胞用顯微鏡進(jìn)行觀察。 （4）給患者移植經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因?yàn)闄C(jī)體把移植的皮膚組織當(dāng)作 進(jìn)行攻擊。,中,抗原,植物組織培養(yǎng)中，外植體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件誘導(dǎo)下，可形成完整的植株。,想一想,那么，離體的動(dòng)物組織細(xì)胞也能夠通過(guò)一定的誘導(dǎo)，發(fā)育成一個(gè)完整的動(dòng)物體嗎？,①分化潛能變?nèi)酰? 其全能性隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變?nèi)酢? （這是對(duì)整體細(xì)胞而言）,②細(xì)胞核仍具有全能性： 細(xì)胞核，含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒(méi)有因細(xì)胞分化而丟失基因，因此高度分化細(xì)胞的細(xì)胞核仍具有全能性。,對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)：,根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn)，怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表現(xiàn)出來(lái)?,克隆動(dòng)物的獲得，實(shí)際上利用核移植技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,想一想,二.動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,將動(dòng)物細(xì)胞(供體)的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞(受體)中，使其重組(重組細(xì)胞)并發(fā)育成為一個(gè)新的胚胎(重組胚胎)，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體（克隆動(dòng)物）。,1.動(dòng)物細(xì)胞核移植概念：,(難度高；成功率低),P51核移植技術(shù),采集卵母細(xì)胞,供體奶牛,,,2.體細(xì)胞核移植的過(guò)程：,供體細(xì)胞（供核）,,細(xì)胞培養(yǎng),體細(xì)胞,卵巢卵母細(xì)胞（MⅡ中期：供質(zhì)）,去核,無(wú)核卵母細(xì)胞,,注入,,,細(xì)胞融合,重組細(xì)胞,,構(gòu)建重組胚胎,,胚胎移植,代孕母體,,生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛,2.共分成兩大階段：核移植和胚胎移植,2.體細(xì)胞核移植的過(guò)程：,,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、核移植、胚胎移植,1.整個(gè)過(guò)程用了哪些技術(shù)？,1.原理？,2.體細(xì)胞核移植的過(guò)程：,動(dòng)物細(xì)胞核的全能性,2.繁殖方式？,無(wú)性繁殖（克隆）,3.有人說(shuō)它上述的克隆牛有三個(gè)母親，對(duì)嗎？,4.新生牛的性別、基因？,性別與供體相同、基因與供體的基本相同,5.體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,不是?？寺?dòng)物的性狀與核供體生物的性狀基本相同，而不是完全形同。因?yàn)榭寺?dòng)物的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。此外，生物的性狀還受環(huán)境的影響。,供體親本：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛（供核）,受體親本：普通奶牛（提供去核卵母細(xì)胞）,代孕親本：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛,7.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植動(dòng)物的核遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有利用價(jià)值的動(dòng)物提供的細(xì)胞。,6.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞，為什么？,10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變。,8.為什么受體細(xì)胞選取減數(shù)第二次分裂中期（MⅡ期）的卵母細(xì)胞？,它是最大的細(xì)胞，細(xì)胞核的位置靠近第一極體，用微吸管可以將其細(xì)胞核和第一極體吸去，易操作。含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)條件（它發(fā)育可直接表達(dá)性狀）。,①物理方法： 電脈沖等 ②化學(xué)方法： 鈣離子載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等,電刺激,11.激活重組細(xì)胞的方法：,9.促進(jìn)供體細(xì)胞和受體細(xì)胞細(xì)胞融合的方法：,10.對(duì)重組細(xì)胞進(jìn)行激活的目的：,激活受體細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過(guò)程,（三）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,1、畜牧業(yè)方面：,2、醫(yī)藥衛(wèi)生方面：,可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育,保護(hù)瀕危物種，增加其存活數(shù)量,轉(zhuǎn)基因的克隆動(dòng)物：生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)；用作器官移植的供體；,3、其他領(lǐng)域,了解胚胎發(fā)育及衰老過(guò)程,用克隆動(dòng)物作為疾病模型，更好追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程、治療疾病,1)成功率很低 代孕母體產(chǎn)下的活的克隆動(dòng)物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。 2)克隆動(dòng)物存在健康問(wèn)題 許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大、異常肥胖、發(fā)育困難、臟器缺陷、免疫缺陷等。 3)克隆技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步改進(jìn) 4)對(duì)克隆動(dòng)物產(chǎn)品的安全性存在爭(zhēng)議,4、體細(xì)胞核移植存在的問(wèn)題,1.下列關(guān)于體細(xì)胞克隆的敘述，錯(cuò)誤的是（ ） A 供體為體細(xì)胞的細(xì)胞核 B 受體為去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) C 細(xì)胞核移植是體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵步驟 D 克隆出的后代與供體的遺傳物質(zhì)和表現(xiàn)型完全一致,D,隨堂練習(xí),2.動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，通常要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充一定濃度的某些物質(zhì)。下圖是血清對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞培養(yǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從該圖提供的信息可以獲得的結(jié)論，錯(cuò)誤是（ ）,A．正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的增殖速率相同 B．有無(wú)血清對(duì)正常細(xì)胞培養(yǎng)的影響不同 C．培養(yǎng)基中補(bǔ)充血清有助于正常細(xì)胞的培養(yǎng) D．培養(yǎng)基中是否補(bǔ)充血清對(duì)癌細(xì)胞的培養(yǎng)影響不大,A,3.下列有關(guān)體細(xì)胞核移植技術(shù)的說(shuō)法不正確的是 ( ) A.體細(xì)胞核移植技術(shù)在多種動(dòng)物中獲得了成功，成功率非常高 B.克隆技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)有待于進(jìn)一步改進(jìn) C.大多數(shù)克隆動(dòng)物還存在一些遺傳和生理缺陷類(lèi)的健康問(wèn)題 D.克隆動(dòng)物食品的安全性問(wèn)題仍然存有爭(zhēng)議,A,4.下列哪項(xiàng)不屬于體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用（ ） A.加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育 B.保護(hù)瀕危物種 C.獲得組織器官異體移植的供體 D.大量產(chǎn)生紫杉醇,D,